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检测微生物检验方法总则 菌落总数检验方法收藏

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1320 admin 发表于 2018-9-6 16:03:11
  微生物检验方法总则 菌落总数检验方法收藏
  
  微生物检验方法总则
  
  General principles
  
  1   范围
  
  本部分规定了化妆品微生物学检验的基本要求。
  
  本部分适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
  
  2   仪器和设备
  
  天平,0-200g,精确至 0.1g。
  
  高压灭菌器。
  
  振荡器。
  
  三角瓶,250mL、150mL。
  
  玻璃珠。
  
  玻璃棒。
  
  灭菌刻度吸管,10mL、1mL。
  
  恒温水浴箱。
  
  均质器或研钵。
  
  灭菌均质袋。
  
3
培养基和试剂
3.1
生理盐水
成分:氯化钠
8.5g
蒸馏水加至
1000mL

  制法:溶解后,分装到加玻璃珠的三角瓶内,每瓶 90mL,121℃高压灭菌 20min。
  
3.2   SCDLP 液体培养基
成分:酪蛋白胨
17g
大豆蛋白胨
3g
氯化钠
5g
磷酸氢二钾
2.5g
葡萄糖
2.5g
卵磷脂
1g
吐温 80
7g
蒸馏水
1000mL

  制法:先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后,再与其他成分混合,加热溶解,调 pH 为 7.2—7.3 分装,每瓶 90mL,121℃高压灭菌 20min。注意振荡,使沉淀于底层的吐温 80
  
  充分混合,冷却至 25℃左右使用。
  
  注:如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨,也可用多胨代替。
  
  3.3   灭菌液体石蜡。
  
  制法:取液体石蜡 50mL,121℃高压灭菌 20min。
  
  3.4   灭菌吐温 80。
  
  制法:取吐温 80 50mL,121℃高压灭菌 20min。
  
  4   样品的采集及注意事项
  
  所采集的样品,应具有代表性,一般视每批化妆品数量大小,随机抽取相应数量的包 装单位。检验时,应从不少于 2 个包装单位的取样中共取 10g 或 10mL。包装量小于 20g 的 样品,采样时可适当增加样品包装数量。
  
  供检样品,应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂,在检验前不得打开,防止 样品被污染。
  
  接到样品后,应立即登记,编写检验序号,并按检验要求尽快检验。如不能及时检 验,样品应置于室温阴凉干燥处,不要冷藏或冷冻。
  
  若只有一个样品而同时需做多种分析,如微生物、毒理、化学等,则宜先取出部分样 品做微生物检验,再将剩余样品做其他分析。
  
  在检验过程中,从打开包装到全部检验操作结束,均须防止微生物的再污染和扩散, 所用器皿及材料均应事先灭菌,全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。
  
  5   供检样品的制备
  
  5.1   液体样品
  
  水溶性的液体样品,用灭菌吸管吸取 10mL 样品加到 90mL 灭菌生理盐水中,混匀 后,制成 1:10 检液。
  
  油性液体样品,取样品 10g,先加 5mL 灭菌液体石蜡混匀,再加 10mL•灭菌的吐温 80,在 40℃—44℃水浴中振荡混合 10min,加入灭菌的生理盐水 75mL(在 40℃—44℃水浴
  
  中预温),在 40℃—44℃水浴中乳化,制成 1:10 的悬液。
  
  5.2   膏、霜、乳剂半固体状样品
  
  亲水性的样品:称取 10g,加到装有玻璃珠及 90mL•灭菌生理盐水的三角瓶中,充 分振荡混匀,静置 15min。用其上清液作为 1:10 的检液。
  
  疏水性样品:称取 10g,置于灭菌的研钵中,加 10mL 灭菌液体石蜡,研磨成粘稠 状,再加入 10mL 灭菌吐温 80,研磨待溶解后,加 70mL 灭菌生理盐水,在 40℃—44℃水
  
  浴中充分混合,制成 1:10 检液。 5.3 固体样品
  
  称取 10g,加到 90mL 灭菌生理盐水中,充分振荡混匀,使其分散混悬,静置后,取上 清液作为 1:10 的检液。
  
  使用均质器时,则采用灭菌均质袋,将上述水溶性膏、霜、粉剂等,称 10g 样品加入 90mL 灭菌生理盐水,均质 1min—2min;疏水性膏、霜及眉笔、口红等,称 10g 样品,加
  
  10mL 灭菌液体石蜡,10mL 吐温 80,70mL 灭菌生理盐水,均质 3min—5min。
  
  2 菌落总数检验方法
  
  Aerobic Bacterial Count
  
  1   范围
  
  本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。
  
  本规范适用于化妆品菌落总数的测定。
  
  2   定义
  
  2.1 菌落总数 Aerobic bacterial count
  
  化妆品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、 pH 值、需氧性质等),1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规
  
  定的条件下生长的嗜中温的需氧性和兼性厌氧菌落总数。
  
  测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度,是对样品进行卫生学总评价的综合依
  
  据。
  
  3   仪器和设备
  
  三角瓶,250mL。
  
  量筒,200mL。
  
  pH 计或精密 pH 试纸。
  
  高压灭菌器。
  
  试管,18mm×150mm。
  
  灭菌平皿,直径 90mm。
  
  灭菌刻度吸管,10mL、1mL。
  
  酒精灯。
  
  恒温培养箱,36℃±1℃。
  
  放大镜。
  
  恒温水浴箱,55℃±1℃。
  
  4   培养基和试剂
  
  生理盐水:见总则中 3.1。
  
  卵磷脂、吐温 80—营养琼脂培养基
  
成分:蛋白胨
20g
牛肉膏
3g
氯化钠
5g
琼脂
15g
卵磷脂
1g
吐温 80
7g
蒸馏水
1000mL

  制法:先将卵磷脂加到少量蒸馏水中,加热溶解,加入吐温 80,将其他成分(除琼脂 外)加到其余的蒸馏水中,溶解。加入已溶解的卵磷脂、•吐温 80,混匀,调 pH 值为 7.1
  
  —7.4,加入琼脂,121℃高压灭菌 20min,储存于冷暗处备用。
  
  4.3   0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC)
  
成分:TTC
0.5g
蒸馏水
100mL

  制法:溶解后过滤除菌,或 115℃高压灭菌 20min,装于棕色试剂瓶,置 4℃冰箱备
  
  用。
  
  5   操作步骤
  
  用灭菌吸管吸取 1:10 稀释的检液 2mL,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿 1mL。另 取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面),更换一支吸管,并充 分混匀,制成 1:100 检液。吸取 2mL,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿 1mL。如样品含 菌量高,还可再稀释成 1:1000,1:10000,……等,每个稀释度应换 1 支吸管。
  
  将融化并冷至 45℃—50℃的卵磷脂吐温 80  营养琼脂培养基倾注到平皿内,每皿约
  
  15mL,随即转动平皿,使样品与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置 36℃ ±1℃培养箱内培养 48h±2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿,加入约 15mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基,待琼脂凝固后,翻转平皿,置 36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h,为空白对
  
  照。
  
  为便于区别化妆品中的颗粒与菌落,可在每 100mL 卵磷脂吐温 80  营养琼脂中加入
  
  1mL 0.5%的 TTC 溶液,如有细菌存在,培养后菌落呈红色,而化妆品的颗粒颜色无变化。
  
  6   菌落计数方法
  
  先用肉眼观察,点数菌落数,然后再用 5 倍—10 倍的放大镜检查,以防遗漏。记下各 平皿的菌落数后,求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落 或花点样菌落蔓延生长时,该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半,而其余一半 中菌落数分布又很均匀,则可将此半个平皿菌落计数后乘以 2,以代表全皿菌落数。
  
  7   菌落计数及报告方法
  
  首先选取平均菌落数在 30—300 之间的平皿,作为菌落总数测定的范围。当只有一个 稀释度的平均菌落数符合此范围时,即以该平皿菌落数乘其稀释倍数报告之(见表 1 中例 1)。
  
  若有两个稀释度,其平均菌落数均在 30—300 之间,•则应求出两菌落总数之比值来决 定,若其比值小于或等于 2,应报告其平均数,若大于 2•则以其中稀释度较低的平皿的菌 落数报告之(见表 1 中例 2 及例 3)。
  
  若所有稀释度的平均菌落数均大于 300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之(见表 1 中例 4)。
  
  若所有稀释度的平均菌落数均小于 30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数 报告之(见表 1 例 5)。
  
  若所有稀释度的平均菌落数均不在 30—300 之间,其中一个稀释度大于 300,而相邻 的另一稀释度小于 30 时,则以接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表 1
  
  中例 6)。
  
  若所有的稀释度均无菌生长,报告数为每 g 或每 mL 小于 10CFU。
  
  菌落计数的报告,菌落数在 10 以内时,按实有数值报告之,大于 100 时,采用二位有
  
  效数字,在二位有效数字后面的数值,应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个 数,可用 10 的指数来表示(见表 1 报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时,应注明样
  
  品的稀释度。
  
  表 1   细菌计数结果及报告方式
  
不同稀释度平均菌落数
两稀释度
菌落总数
报告方式
10-1
10-2
10-3
菌数之比
(CFU/mL 或 CFU/g)  (CFU/mL 或 CFU/g)
1
1365
164
20
16400
16000
或 1.6×104
2
2760
295
46
1.6
38000
38000
或 3.8×104
3
2890
271
60
2.2
27100
27000
或 2.7×104
4
不可计
4650
513
513000
510000
或 5.1×105
5
27
11
5
270
270
或 2.7×102
6
不可计
305
12
30500
31000
或 3.1×104
7
0
0
0
<1×10
<10

  注:CFU-菌落形成单位。
  
  7.8 按重量取样的样品以 CFU/g 为单位报告;按体积取样的样品以 CFU/mL 为单位报告。
  
  本文来源于化妆品安全技术规范2015
  
  法规标准、检测方法、禁用限用、包装标签、注册备案、最新最全、专业权威;
  
  产品研发、生产管理、质量管理、包装设计、销售管理、培训指导,行业必备。
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